姚琴 赵慧毅 谢柏臻
目的:探讨Ezrin基因沉默联合热休克蛋白（heat shock protein,HSP）70诱导的免疫杀伤对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响.
方法:采用人成骨肉瘤MG63细胞系作为研究对象,将人HSP70和Ezrin-shRNA的DNA片段分别克隆至含CMV和pU6双启动子的表达载体pGFP-V-RS中构建含HSP70和Ezrin-shRNA的真核表达载体pGFP-V-RS-shRNA和pGFP-V-RS-shRNA-HSP70.重组质粒分别转染入细胞,筛选出稳定表达的细胞克隆.荧光显微镜观察细胞形态及转染效果;荧光定量RT-PCR及蛋白印迹western blot检测稳定转染细胞株Eznn和HSP70基因及蛋白水平的变化;采用MTT、流式细胞术检测细胞增殖、凋亡能力变化,Western blot检测凋亡及周期相关蛋白表达量变化;MTT法检测HSP70刺激产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对靶肿瘤细胞的杀伤作用.
结果:荧光图像及基因和蛋白表达分析证实,首次成功构建同时沉默Ezrin和过表达HSP70的特异性载体.较单纯沉默Ezrin,同时过表达HSP70会在一定程度上减弱沉默Ezrin蛋白促进细胞凋亡和抑制增殖的效果,但与对照细胞相比,M63细胞凋亡率仍明显上升,自11.01％±0.22％上升至24.28％±0.50％,增殖速度则自395.14％±2.24％减少至310.00％±2.83％.另外,Western blot检测发现Ezrin-shRNA可促进凋亡基因Bax的表达,相反可降低抗凋亡基因Bcl-2和细胞周期蛋白Cyclin D1的表达.而Ezrin-shRNMHSP70组较Ezrin-shRNA组促Bax表达和降低Bcl-2、细胞周期蛋白Cyclin D1表达有所减弱,但较阴性对照组仍有明显效果.MG63细胞的CTL细胞毒杀伤效应显示各效靶浓度下CT＋IL-2＋HSP70组的杀伤活性高于CT＋IL-2组,最高达56.33％±1.95％.
结论: 同时沉默Ezrin、过表达HSP70既可以促进骨肉瘤细胞凋亡抑制其增殖,并利用HSP70诱导的CTL,增强对靶肿瘤细胞的杀伤作用.
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