椎间盘突出的主要病因之一是过度力学负载及退变导致纤维环破裂，从而引发髓核突出。因此，对退变及破裂的纤维环进行再生修复具有重要意义。Mohawk (Mkx)是三氨基环酸超家族的成员之一，是肌腱发育过程中肌腱细胞所表达的非典型的同源异型盒基因，在许多细胞增殖和分化及组织器官发育过程中均不可或缺。近年来研究证实，转录因子Mkx是纤维环形成、发育和分化的关键因子之一。然而Mkx在纤维环再生修复中的应用目前尚未见报道。
来自日本的科学家首次研究并发现，Mkx在小鼠椎间盘发育过程中高表达于E14.5胚胎，并且在纤维环外区细胞从聚集到分化（E13.5-E14.5）过程中Mkx的表达量明显变多，在对人纤维环的研究中也得到了同样的结果，说明Mkx主要表达于外区纤维环（图1）。将小鼠Mkx基因敲除后，H&E染色和透射电镜观察均表明，在第10周时Mkx-/-小鼠纤维环厚度以及胶原纤维数量和直径与Mkx+/+小鼠相比，其纤维环厚度变薄，胶原纤维数量和直径减低（图2）。
图1 Mkx高表达于小鼠外区纤维环。（a）左图为E14.5野生型小鼠椎间盘番红O-快绿染色，中间和右侧两图为Mkx+/+小鼠椎间盘的免疫组化染色和Mkx原位杂交情况。（b）上两排图示野生型小鼠椎间盘从胚胎时期（E18.5）到生长发育期（4周）的番红O-快绿以及Masson染色情况。下排图示Mkx+/+小鼠椎间盘免疫组化染色情况。（c）上排图示10周野生型小鼠椎间盘番红O-快绿染色，下排图示Mkx+/+小鼠椎间盘免疫组化染色情况。（d-f）示人体纤维环内、外区免疫组化和H&E染色情况，以及Mkx表达情况分布图表。
图2 Mkx-/-小鼠的纤维环厚度及密度均显著低于野生型小鼠。(a，b)H&E染色显示,在第10周时Mkx+/+小鼠纤维环厚度(246.9±23.04μm)显著厚于Mkx-/-小鼠(157.5±21.16μm)。(c-e)透射电镜进一步表明，10周时Mkx+/+小鼠纤维环中胶原纤维数量及直径均显著超过Mkx-/-小鼠。
与Mkx+/+小鼠相比，Mkx-/-小鼠外区纤维环主要基质组成Col1a1和Col1a2减少，同时维持纤维环外区生理环境的SLRP家族以及肌腱生成相关基因表达降低（图3a,c）。对人Mkx-/-纤维环细胞进行研究，也得到同样的结果（图3b,d）。通过连续观察Mkx-/-小鼠纤维环早期退变情况，发现Mkx-/-小鼠的纤维环在12月以后发生明显退变（图4）。这些结果说明Mkx在促进小鼠纤维环胶原纤维形成、维持纤维环正常生理功能过程中发挥重要作用。
图3 Mkx-/-纤维环细胞的基因表达情况。(a)RT-PCR结果显示，Mkx-/-小鼠及Mkx+/+小鼠中Col1a1、Col1a2、SLRP家族基因以及肌腱生成相关基因表达情况。(b)Mkx-/-人纤维环细胞肌腱生成相关基因如SCX,TNMD,COL14A1,TNC,BGN和TNXB表达情况。（c）免疫荧光显示在第10周时Mkx-/-小鼠Bgn和Col14蛋白表达较Mkx+/+小鼠降低。（d）Western Blot表明在Mkx-/-人纤维环细胞中BGN以及SOX9表达降低。
图4 Mkx-/-小鼠纤维环早期退变情况。(a)番红O-快绿染色显示在10周以及6个月时，Mkx-/-小鼠椎间盘未发生明显变化，而在12以及21个月时，内区纤维环以及髓核细胞缩小，番红染色加深。（b）在第21个月时，Mkx-/-小鼠椎体出现骨刺生长。(c)Mkx-/-小鼠的椎间盘退变指数在12以及21个月明显高于Mkx+/+小鼠。
Mkx不仅在纤维环形成发育过程中发挥重要作用，而且能够调控骨髓间充质干细胞（MSC)的细胞外基质基因表达和蛋白质生成。以腺病毒为载体Mkx转染MSC形成Mkx基因过表达后，发现外源性Mkx在MSC成肌腱分化过程中能够促进肌腱形成相关基因如Tnc、Tnxb、Tnmd和相关蛋白(Coll1a1)的表达，而这些细胞外基质基因表达及蛋白质的合成对外区纤维环的再生修复起关键作用（图5）。这进一步说明了Mkx在小鼠外区纤维环胶原纤维形成过程中扮演重要角色，它可以防止纤维环的早期退变，最终维持椎间盘的稳定。
图5 Mkx促使间充质干细胞向类肌腱细胞分化。（a,b）表示Mkx基因过表达的C3H10T1/2-VM细胞较C3H10T1/2-V细胞呈梭型，以及两组细胞Scx, Col1a1, Col1a2, Col14a1, Tnc以及Dcn等肌腱生成相关基因表达情况。（c-e) C3H10T1/2-VM细胞软骨以及脂肪生成相关基因表达降低，成骨相关基因表达升高。（f)Western Blot检测C3H10T1/2-V和C3H10T1/2-VM细胞Col1,Dcn和Sox9的表达情况。
在小鼠纤维环退变模型中，应用过表达Mkx的MSC进行纤维环再生修复，结果发现：修复区域胶原纤维直径及密度增加，椎间盘退变指数较对照组降低（图6）。这一研究为纤维环组织工程修复提供了新的思路。
图6 过表达Mkx的间充质干细胞促进纤维环再生修复情况。(a-d)分别将C3H10T1/2-V细胞和过表达Mkx的MSCs的C3H10T1/2-VM细胞植入到小鼠纤维环缺损部位中，观察两者修复情况。(f-i)在第8周时，分别用HE染色以及免疫组化的方法检测了两组纤维环修复情况。(j-l)透射电镜示C3H10T1/2-VM组纤维环外区胶原纤维直径及数量较C3H10T1/2-V组增大。（m,n）番红O-快绿染色示C3H10T1/2-V组及C3H10T1/2-VM组椎间盘变化情况。（o）C3H10T1/2-V组及C3H10T1/2-VM组椎间盘退变指数。
本研究由东京医科和牙科大学（Tokyo Medical and Dental University）Hiroshi Asahara教授及其合作团队完成，2016年8月16日发表于Nature Communications。
论文信息：
Nakamichi R, Ito Y, Inui M, Onizuka N,Kayama T, Kataoka K, Suzuki H, Mori M, Inagawa M, Ichinose S, Lotz MK, Sakai D,Masuda K, Ozaki T, Asahara H*. Mohawk promotes the maintenance and regenerationof the outer annulus fibrosus of intervertebral discs. Nat Commun 2016,7:12503.
论文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4990710/
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