雪旺细胞纯化培养及体外复合猪小肠黏膜下层的实验研究

刘宏银     冯喆     柏琳     侯江龙       罗静聪     杨志明      解慧琪

摘要:  目的 改进雪旺细胞（Schwann cells，SCs）原代培养方法，以获得大量高纯度SCs；研究猪小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）与SCs的生物相容性；通过复合SCs，使SIS负载NGF。 方法取2～3日龄SD乳鼠双侧坐骨神经，以胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶分步消化，差速贴壁20 min，G418处理48 h，含2.5%FBS的H-DMEM培养基培养；MTT法检测SCs增殖情况，抗S-100免疫荧光染色检测SCs纯度。将第3代SCs和SIS复合培养，行HE染色和扫描电镜观察两者复合生长情况，复合培养1、2、3、4、5、7 d ELISA法检测培养上清中NGF含量。复合培养3、5、7、10、13、15 d后反复冻融脱细胞处理，ELISA法检测脱细胞后SIS中NGF含量。 结果纯化后的SCs纯度达98%以上；MTT检测示SCs传代后3 d进入对数生长期，7 d后进入平台期。HE染色和扫描电镜观察均显示SCs在SIS上黏附良好，细胞形态呈纺锤形，有明显突起，分泌较多细胞外基质。ELISA检测发现SCs与SIS复合培养后，培养上清中的NGF含量随时间延长而逐渐升高，与同时间点对照组比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。通过与SCs复合后反复冻融脱细胞，SIS中NGF含量在培养10 d达峰值（414.29 ± 20.87）pg/cm2，显著高于未复合细胞的单纯SIS材料中NGF含量（4.92 ± 2.06） pg/ cm2，比较差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论联合双酶消化、差速贴壁、G418处理、低浓度酶消化和低浓度血清培养，可在较短时间内获得大量高纯度SCs。SCs与SIS复合生长相容性好，不影响SCs的NGF分泌。通过与SCs的复合、反复冻融脱细胞后，SIS中负载了大量NGF，有望成为良好的神经修复材料。