pELNS-BMPs与pELNS-Wnt3a联合构建表达对成骨细胞系成骨效能的作用研究

阮文东  雪原  宗亚琪  孙超

目的 构建第三代自体失活的骨形成蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）-2、4、6、7、9和Wnt3a慢病毒表达载体,并整合入小鼠间质干细胞MC3T3-E1的基因组中,构建成骨诱导因子基因修饰的小鼠间质干细胞,探讨各成骨诱导因子的成骨分化能力及通过双基因联合转染提高成骨分化能力的有效性。

方法 以cDNA文库为模板,构建BMP-2、4、6、7、9及Wnt3a基因表达质粒载体,酶切鉴定重组体且经测序进一步确定后,与pLP/VSVG、pLP1、pLP2质粒共转染293FT细胞。包装pELNS-BMP-2、4、6、7、9及Wnt3a后转染小鼠间质干细胞MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染效果。Real time PCR检测Runx2 mRNA的表达水平,鉴定各成骨诱导因子的单独转染效能。双基因联合转染（共8组）MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染效果;应用ELISA检测MC3T3-E1细胞培养上清中骨钙素（bone gla protein, BGP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）的表达水平;应用Real time PCR检测Runx2 mRNA的表达水平;应用Western blot检测BMP-2、4、6、7、9及Wnt3a蛋白的表达水平,鉴定双基因联合转染的成骨分化效能。

结果 重组慢病毒pELNS-BMP-2、4、6、7、9及pELNS-Wnt3a构建成功,成功转染MC3T3-E1细胞;Runx2 mRNA表达水平：BMP-2>BMP4->BMP-9>BMP-7>Wnt3a>BMP-6。双基因（共8组）联合转染MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染成功;Runx2 mRNA表达水平、BGP和ALP表达水平结果显示,BMP-2与BMP-7共转染成骨效率最高,Western blot证实BMP-2和BMP-7联合转染MC3T3-E1细胞后BMP-2、4、6、7、9及Wnt3a蛋白表达升高。

结论 成功构建第三代慢病毒载体pELNS可将BMP-2、4、6、7、9和Wnt3a导入小鼠间质干细胞MC3T3-E1,使其有效表达;各成骨诱导因子能促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化,BMP-2和BMP-7双基因联合转染能有效提高成骨转化。