三种亚型软骨组织来源干细胞的分离培养及鉴定

薛珂　　张小蝶　　刘凯

　　目的:分离培养猪不同亚型软骨组织（弹性软骨、透明软骨以及纤维软骨）来源干细胞并鉴定，为软骨组织工程提供理想种子细胞。

　　方法:利用纤维连接蛋白黏附法分别从猪耳软骨、关节软骨以及椎间盘软骨中分离培养干细胞，并进行传代。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，流式细胞术鉴定细胞表面抗原表达水平（阳性标志物CD29、CD90及阴性标志物CD34、CD45），单克隆形成实验鉴定软骨干细胞单克隆形成能力。三向诱导分化鉴定软骨来源干细胞的成软骨、成骨及成脂多向分化潜能。RT-PCR检测成骨（Ⅰ型胶原、Ⅹ型胶原）、成软骨[蛋白聚糖（Aggrecan）、II型胶原]、成脂[脂联素(Adiponectin)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)]相关基因表达，并以猪BMSCs作为对照。

　　结果:通过纤维连接蛋白黏附法分别从耳软骨（弹性软骨）、关节软骨（透明软骨）、椎间盘软骨（纤维软骨）分选出一群细胞，细胞高表达干细胞表面阳性标志物CD29、CD90，几乎不表达干细胞表面阴性标志物CD34、CD45。经过体外2周培养，单个细胞均能形成细胞克隆。三向诱导分化显示软骨来源的干细胞具备成软骨、成骨和成脂分化能力。RT-PCR 结果显示，成骨诱导后关节和椎间盘来源软骨干细胞的Ⅰ、Ⅹ型胶原基因相对表达量明显高于BMSCs（P<0.05），耳软骨来源干细胞与BMSCs比较差异无统计学意义（P>0.05）；成软骨诱导后，3种亚型软骨组织来源干细胞Aggrecan、Ⅱ型胶原基因相对表达量均高于BMSCs （P<0.05）；成脂诱导后，3种来源软骨干细胞Adiponectin及FAS基因相对表达量均低于BMSCs，但比较差异无统计学意义（P>0.05）。

　　结论:不同亚型的猪软骨组织中均存在软骨干细胞，具有干细胞的典型特征。