嗅鞘细胞无血清上清液诱导C17.2神经干细胞定向分化及分化后细胞活力检测

王磊 段答 赵振宇 滕晓华 刘波 葛丽特 卢明

　　目的:探讨体外采用嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）无血清上清液诱导小鼠C17.2神经干细胞（neural stem cells，NSCs）向神经元定向分化及分化后的细胞活力。

　　方法:采用新生3 d昆明小鼠嗅球，分离培养OECs，并制备无血清上清液。C17.2 NSCs置于含15%FBS的H-DMEM/F12培养基培养，传至第3代，待细胞生长至80%融合时，分别加入OECs无血清上清液（实验组）、H-DMEM/F12培养基（对照组）诱导培养；以未诱导的C17.2 NSCs作为空白对照组。倒置显微镜下观察诱导后细胞生长情况，于诱导5 d后收集细胞行微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）及β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulin-Ⅲ）免疫荧光染色鉴定，Western blot检测细胞巢蛋白（Nestin）、β-tubulin-Ⅲ、MAP-2蛋白表达情况，检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）漏出率并行MTT法检测细胞活力。

　　结果:实验组：诱导后24 h细胞胞体开始收缩，3 d后分化的细胞明显增多，突触增长；对照组：诱导后24 h细胞形态无明显改变，3 d后细胞胞体皱缩，细胞核质浓缩，并发生细胞裂解、破碎。诱导后5 d，免疫荧光染色示实验组分化后细胞β-tubulin- Ⅲ和MAP-2表达均呈阳性，对照组及空白对照组均无表达。Western blot检测显示实验组中NSCs标志物Nestin蛋白表达明显减少，神经元标志物β-tubulin- Ⅲ和MAP-2 表达增加，与对照组及空白对照组比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。实验组LDH漏出率为130.60% ± 6.86%，显著低于对照组的178.20% ± 5.44%；细胞活力为62.20% ± 3.82%，显著高于对照组的18.00% ± 3.83%；比较差异有统计学意义（P < 0.05）；但均低于空白对照组的100%（P < 0.05）。

　　结论:含有OECs分泌蛋白的OECs无血清上清液不仅能诱导NSCs向神经元分化，还能维持分化后细胞活力。