慢病毒载体介导VEGF165基因修饰大鼠毛囊干细胞的实验研究

郑 宣    许世超    全仁夫

     目的:为获得持续高表达VEGF165的大鼠毛囊干细胞（rat hair follicle stem cells，rHFSCs），观察慢病毒载体介导VEGF165基因对rHFSCs的转染及其表达情况。

     方法:切取1周龄SD大鼠触须部皮肤，Dispase酶和Ⅳ型胶原酶混合消化，显微镜下分离毛囊隆突部，组织块培养rHFSCs；经Ⅳ型胶原差速贴壁纯化后，分别取不同代次rHFSCs绘制细胞生长曲线；联合应用免疫荧光染色及实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR，RT-qPCR）检测相关基因鉴定细胞。钙转法包装pLV-内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）-VEGF165-增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）（实验组）和pLV-IRES-EGFP空载体（对照组）慢病毒，用两组慢病毒转染rHFSCs。倒置荧光显微镜下观察实验组绿色荧光表达情况，RT-PCR和Western blot法分别检测VEGF165 mRNA和蛋白表达情况。

     结果:分离、培养、纯化的rHFSCs呈典型“铺路石”状，贴壁较牢，克隆形成能力强；纯化后细胞培养1～2 d处于生长潜伏期，5～6 d处于对数生长期；细胞免疫荧光染色可见毛囊干细胞标志物角蛋白15（cytokeratin 15，CK15）、整合素α6和整合素β1表达呈阳性；RT-qPCR检测可见干细胞标志物CK15、CK19、整合素α6和整合素β1表达量高，而表皮干细胞标志物CD34和角质形成细胞标志物CK10表达量均较低。倒置荧光显微镜观察示，实验组慢病毒介导VEGF165基因转染14 d后转染效率可达85.76% ± 1.91%；RT-PCR和Western blot检测示，实验组VEGF165 mRNA和蛋白表达均呈阳性，对照组均呈阴性。

     结论:经显微镜联合组织块分离培养、Ⅳ型胶原差速贴壁筛选后，可得到高纯度rHFSCs，细胞增殖能力强。慢病毒介导的VEGF165基因修饰方法可成功转染并得到高表达VEGF165 mRNA和蛋白的rHFSCs，可为组织工程构建人工毛囊、血管及皮肤等提供良好的种子细胞。