TGF-β3基因转染诱导滇南小耳猪BMSCs向软骨分化的初步研究

王慧建    李彦林    陈建明    王 鑫    赵沣凯    曹树海

     目的:观察TGF-β3基因转染滇南小耳猪BMSCs后目的基因的表达和向软骨细胞分化的作用。

     方法:以血清5型重组腺病毒（recombinant adenovirus 5，rAd5）构建系统为基因载体，包装为重组腺病毒rAd5-TGF-β3，行双酶切及PCR鉴定。采集2月龄滇南小耳猪（体重12～15 kg）骨髓分离培养制备BMSCs，取第2代细胞用于实验。将实验分为3组，实验组和对照组分别用rAd5-TGF-β3、人腺病毒阴性空病毒载体转染BMSCs，以未转染的BMSCs为空白对照组。流式细胞仪检测转染效率，免疫荧光染色、Western blot检测各组TGF-β3蛋白表达情况；培养后各时间点倒置相差显微镜观察细胞形态变化，Western blot检测各组Ⅱ型胶原蛋白表达情况。

     结果:rAd5-TGF-β3重组腺病毒成功构建并转染BMSCs，在细胞内表达并迅速扩增，免疫荧光显微镜下可观察到强绿色荧光。流式细胞仪检测示转染72 h时病毒达最佳转染效果（转染效率为84.86%）。免疫荧光染色示，rAd5-TGF-β3 转染BMSCs 72 h，细胞质内有明显TGF-β3蛋白表达；转染后7、21 d Western blot检测示，实验组在相对分子质量为30 × 103处有TGF-β3阳性条带，而对照组和空白对照组均呈阴性。转染后体外培养，倒置相差显微镜下示实验组向软骨细胞分化明显。培养21 d时Western blot检测示，实验组在相对分子质量为130 × 103处有Ⅱ型胶原阳性条带，对照组和空白对照组均呈阴性。

     结论:重组腺病毒rAd5-TGF-β3可成功转染BMSCs，TGF-β3蛋白可稳定表达，并促使BMSCs向软骨细胞方向分化，为软骨缺损修复的局部基因治疗奠定了实验基础。