软骨源性形态发生蛋白1转基因细胞片的初步探讨

姚 梅    崔 颖    王月田    张 本    付文举

     目的:探讨软骨源性形态发生蛋白1（cartilage-derived morphogenetic protein 1，CDMP1）转基因细胞片的构建及其活性鉴定。

     方法:取1月龄新西兰白兔骨髓分离培养BMSCs，取第3～6代细胞进行实验。实验分为3 组，A组：腺病毒（adenovirus，Ad）-巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）-人CDMP1（human CDMP1，hCDMP1）-内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）-增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）转染BMSCs，B组：Ad-CMV-EGFP（空载体腺病毒）转染BMSCs，C组：未转染的BMSCs。倒置荧光显微镜观察3组细胞荧光表达情况，MTT法检测3组细胞增殖活力。将3组处于对数生长期的细胞接种于温度敏感性6孔板获得细胞片，行形态学及HE染色观察，RT-PCR及Western blot检测3组细胞片hCDMP1和Ⅱ型胶原mRNA及蛋白表达，阿利新蓝染色检测糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAG）表达。

     结果:倒置荧光显微镜下观察示转染细胞在72 h表达明亮荧光，转染效率达90%；MTT法检测示，3组细胞生长曲线基本呈S形，培养1～9 d吸光度（A）值比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。通过温度敏感性6孔板体外可成功收获完整的三维立体细胞片结构，RT-PCR及Western blot检测示，A组细胞片中hCDMP1和Ⅱ型胶原mRNA及蛋白均呈阳性表达，B、C组均为阴性。HE染色和阿利新蓝染色示，A组纤维组织丰富，细胞外基质较多，蓝色异染颗粒多；B、C组细胞外基质相对较少，无明显特异性蓝染颗粒；A组GAG阳性染色面积明显低于B、C组，灰度值明显高于B、C组（P < 0.05）。

     结论:hCDMP1基因转染的BMSCs细胞片能表达Ⅱ型胶原和GAG，具有成软骨活性，其克服了传统组织工程中细胞利用率低、支架异质性等缺点，有望构建出致密的组织工程软骨，为软骨组织工程进一步发展提供了新思路。